精准检测疾病SV—PacBio SMRT技高一筹
2019.03.12

目前二代测序广泛应用于人基因组测序以检测疾病SNP、Indel等,但传统的二代测序不能满足高GC和重复序列区域测序的准确性,导致无法检测到很多引起疾病的大片段结构变异和多态性位点。PacBio三代单分子实时测序技术以其超长读长、无GC偏好性、覆盖度均一等优势可轻松获取人基因组高GC和重复序列区域的信息,可全面挖掘基因组的大片段结构变异信息,对临床疾病诊断和治疗具有重要意义。下面通过2篇案例带大家深入了解一下PacBio SMRT测序在临床疾病SV研究中的应用~


PacBio人基因组重测序发现Carney综合症相关结构变异[1]

发表期刊

Genetics in medicine


影响因子

9.937


材料选择

Carney综合征患者


测序策略

约8.6X低深度人重测序


1552446319259698.png

图1 研究思路图


本文的研究对象为在成长过程中表现出疑似Carney综合征表型的患者(Carney综合征是由粘液瘤、皮肤色素沉着、内分泌功能亢进所组成的常染色体显性遗传综合征),先进行Illumina二代测序未检测到任何与临床表型相关的致病变异,因此使用PacBio低覆盖度(8.6X)全基因组测序来检测结构变异SV,共发现了6,971个缺失和6,821个50bp以上的插入变异。通过与阴性对照对比,并与Refseq基因外显子和蛋白质编码序列比对,侧重分析疾病相关基因的外显子区域,筛选出55个SV,其中有6个SV(3个缺失,3个插入)在OMIM(人类基因和遗传表型关联的综合性数据库 )中与遗传疾病相关。


1552445287165539.jpg

图2 PacBio测序发现PRKAR1A基因中的杂合缺失


通过分析表型相关性,发现最佳候选变异为一段2,184bp的杂合缺失,该变异覆盖PRKAR1A编码基因的第一个外显子,PRKAR1A基因为抑癌基因,其突变可能与内分泌肿瘤的发生有关,可导致Carney综合征。Sanger测序结果也发现此缺失突变的存在,并且证实了PacBio可以精确检测出缺失断裂点。


PacBio人基因组重测序发现癫痫相关结构变异[2]

发表期刊

Journal of human genetics


影响因子

2.942


材料选择

癫痫患者


测序策略

6-13X低深度人重测序


1552445575777407.png

图3 研究思路图


本文研究了一个患有进行性肌阵挛性癫痫的家庭,其中两个患病姐弟表现出类似的临床上的破坏性神经退行性表型,先进行了全外显子组测序但没有发现致病变异,因此进行了PacBio长读长测序,使用低覆盖度(6X)全基因组测序检测结构变异SV,发现17,165个SV(7,216个缺失和9,949个插入)。通过与阴性对照对比,并与Refseq基因外显子和蛋白质编码序列比对,侧重分析疾病相关基因的外显子区域,筛选出50个SV,其中有5个SV(2个缺失,3个插入)在OMIM中与遗传疾病相关,存在于常染色体隐性表型相关基因上。


1552445656720597.jpg

图4 候选SV筛选


1552445712630901.jpg

图5 PacBio测序发现CLN6基因中的缺失变异


其中,PacBio测序结果显示CLN6基因上一个12.4kb的缺失变异,跨越其第一个编码外显子,是最佳候选变异,因CLN6双等位基因突变会导致常染色体隐性癫痫,与患病姐弟的临床特征相符。该缺失包括起始密码子,存在于含有多个重复区域的高GC区。这些结果表明PacBio长读长全基因组测序可以发现全外显子测序难以检测到的变异信息。


1552445819335120.png

图6 CLN6缺失变异家系图谱


通过RT-PCR证实了患者及其亲本分别为纯合和杂合缺失,Southern印迹分析验证了PacBio测序发现的缺失片段的大小和位置,结合Sanger测序证实了缺失片段两侧的Alu元件,提示Alu-Alu介导的重组(AAMR),可能是导致此长片段缺失的机制。

 

这两篇文章充分表明即使低深度的PacBio SMRT测序也能够对全基因组范围内的结构变异进行有效检出,尤其是对于二代测序不能有效覆盖的高GC区域和重复序列区域,PacBio SMRT测序可以通过超长读长、无GC偏好性、覆盖度均一的优势对这些区域进行有效覆盖。当前在医学领域越来越多的科研文献使用PacBio SMRT测序技术来解析人类疾病。随着PacBio最近一次V3.0版本试剂升级以及即将到来的8M测序芯片,未来必然会大大拓展PacBio SMRT测序在人类基因组检测领域的应用,发挥其潜在临床效用。


目前安诺基因PacBio三代人基因组重测序,可对大片段基因组结构变异进行检测、过滤和注释,通过可视化的方法描绘基因组变异图谱。同时研发的高级分析,可基于标准分析获得的各类基因组变异信息,进行罕见变异分析、新生变异分析、显性/隐性遗传模式分析、复合杂合遗传模式分析以及靶向药物反应分析等,助力深入研究核心家系遗传病、罕见病、肿瘤成对样本等。如有任何需求和问题欢迎您随时留言咨询~


参考文献

[1] Merker JD, Wenger AM, Sneddon T, et al. Long-read genome sequencing identifies causal structural variation in a Mendelian disease[J]. 2018, Genet Med, .01.20

[2] Mizuguchi T, Suzuki T, Abe C, et al. A 12-kbstructural variation in progressive myoclonic epilepsy was newly identified bylong-read whole-genome sequencing[J]. 2019, J HumGenet, 02.13

分享:
Copyright ? 安诺优达基因科技(北京)有限公司 京ICP备12029022号-1
大香蕉网站,大香蕉伊人久草AV,大香蕉网,伊人在线4